Nuovi strumenti genetici rivelano il duplice ruolo delle cellule senescenti nelle malattie del fegato, con i macrofagi che guidano la fibrosi e le cellule endoteliali che riparano i danni, aprendo la strada a terapie mirate.

Studia: Identificazione dei ruoli funzionali specifici della senescenza tra i tipi cellulari. Credito immagine: Crystal Light/Shutterstock

In un recente studio pubblicato sulla rivista cellai ricercatori hanno scoperto i diversi ruoli funzionali di pagina 16^Ink4a+ Cellule senescenti in diversi tipi cellulari nell’invecchiamento, nella rigenerazione e nella malattia, utilizzando nuovi strumenti genetici per tracciare, sradicare e manipolare queste cellule in vivo.

sfondo

La senescenza cellulare è fondamentale in processi come l’invecchiamento, il cancro e le malattie. Indotto dallo stress, comporta l’arresto del ciclo cellulare, gli inibitori della chinasi ciclina-dipendente (CDK) e il fenotipo secretivo associato alla senescenza (SASP). Le cellule senescenti hanno ruoli deleteri, come promuovere l’invecchiamento e le malattie, e ruoli benefici, come la soppressione del tumore e la riparazione dei tessuti. Sono necessarie ulteriori ricerche per chiarire i loro ruoli specifici del tipo cellulare e sviluppare trattamenti che ne bilancino gli effetti positivi e negativi.

A proposito dello studio

La reazione a catena della polimerasi genomica (PCR) è stata eseguita lisando code o tessuti di topo con tampone di lisi e proteinasi K a 55°C per oltre sei ore. La miscela è stata poi centrifugata per raccogliere il surnatante, che è stato fatto precipitare con isopropanolo per ottenere DNA genomico. Questo DNA è stato lavato con etanolo al 70% e sciolto in acqua deionizzata. I topi sono stati genotipizzati utilizzando primer specifici per le sequenze nucleiniche.

Per gli esperimenti sui fibroblasti embrionali di topo, gli embrioni del giorno embrionale 13,5 (E13.5) sono stati trypsinizzati e le cellule sono state raccolte attraverso un colino cellulare. Le cellule sono state coltivate nel mezzo di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS) e antibiotici, con i media cambiati ogni 2-3 giorni. Il modello di fibrosi epatica indotta dal tetracloruro di carbonio (CCl4) prevede la somministrazione intraperitoneale di tetracloruro di carbonio in dosi crescenti, seguita dalla raccolta del fegato per l’analisi. In questo modello sono stati utilizzati solo topi femmine per evitare differenze di sesso.

La steatoepatite non alcolica (NASH) è stata indotta utilizzando una dieta a base di aminoacidi L carente di colina per 12 settimane, utilizzando solo topi maschi per prevenire differenze legate al sesso. Per la trasfezione di acido ribonucleico interferente di piccole dimensioni (siRNA), le cellule sono state trasfettate con siRNA utilizzando il reagente di interferenza RNA lipofectamina MAX (RNAiMAX), seguito da incubazione in terreno completo contenente FBS prima della raccolta per l’analisi.

Risultati dello studio

pagina 16^Ink4a+codificato da CDK 2a (Cdkn2a), è un marcatore ampiamente riconosciuto della senescenza cellulare, che è fondamentale in processi come l’invecchiamento e le malattie. Una linea reporter basata sulla fluorescenza chiamata p16-tdTomato (tdT) è stata sviluppata per indagare la sua espressione in diversi tipi cellulari, consentendo la risoluzione di singole cellule pagina 16^Ink4a+ esprimere. La validazione con fibroblasti embrionali di topo (MEF) ha confermato il fenotipo senescente in pagina 16^Ink4a+ cellule con l’età, caratterizzate da un aumento della colorazione della β-galattosidasi (SA-β-Gal) associata alla senescenza e da una diminuzione dell’espressione di Ki67. Inoltre, le cellule p16-tdT esprimevano alti livelli di altri marcatori di senescenza come p21 e interleuchina (IL)-6, migliorando l’affidabilità di questo modello di studio. pagina 16^Ink4a+ esprimere.

L’imaging a fluorescenza di vari organi di topi p16-tdT invecchiati ha rivelato un aumento delle cellule tdT+ con l’età, soprattutto nei neuroni della corteccia cerebrale e nelle cellule endocrine del pancreas. Queste cellule tdT+ hanno mostrato robusti fenotipi associati alla senescenza, come elevati fattori SASP e ridotta capacità proliferativa, sottolineando la diversità delle popolazioni di cellule senescenti nei tessuti invecchiati.

Per studiare il ruolo delle cellule senescenti nella fibrosi epatica, i topi p16-tdT sono stati trattati con CCl4, che ha indotto la fibrosi. L’arricchimento delle cellule senescenti tdT+ è stato osservato nelle aree fibrotiche, soprattutto nei macrofagi e nelle cellule endoteliali (EC), ma non negli epatociti. La citometria a flusso e l’immunocolorazione hanno ulteriormente convalidato l’espressione di sottoinsiemi di questi tipi di cellule pagina 16^Ink4a+ Presentava caratteristiche di invecchiamento. Il sequenziamento dell’RNA a cellula singola (scRNA-seq) ha confermato questi risultati, dimostrando la regolazione dei marcatori di invecchiamento e dei fattori SASP inpagina 16^Ink4a+ Macrofagi ed EC.

Per seguire il destino pagina 16^Ink4a+ cellule durante il danno epatico e la riparazione, è stato sviluppato il sistema Sn-pTracer, che consente l’etichettatura specifica dei macrofagi senescenti e della CE. I risultati lo hanno rivelato pagina 16^Ink4a+ I macrofagi, che erano marcati durante l’infezione, si sono esauriti durante la riparazione, mentre gli EC persistevano e mostravano segni di senescenza ridotti nel tempo.

Inoltre, per sradicarli è stato sviluppato un nuovo strumento genetico chiamato Sn-cTracer pagina 16^Ink4a+ cellule. Ablazione pagina 16^Ink4a+ I macrofagi nella cirrosi epatica hanno ridotto significativamente la fibrosi, eliminandola pagina 16^Ink4a+ Gli EC hanno esacerbato il danno epatico. Questa scoperta differenziale ha dimostrato che i macrofagi senescenti promuovono la fibrosi, mentre le cellule dendritiche senescenti svolgono un ruolo compensatorio.

E infine, la riprogrammazione pagina 16^Ink4a+ Le EC attraverso la sovraespressione di Kdr in un modello di lesione epatica hanno ridotto significativamente la fibrosi, evidenziando il potenziale terapeutico di prendere di mira le popolazioni di cellule senescenti in un modo specifico per il tipo di cellula per migliorare la riparazione dei tessuti e ridurre la fibrosi.

Nuovi strumenti genetici

Lo studio ha introdotto due potenti strumenti genetici, Sn-pTracer e Sn-cTracer, progettati per tracciare e manipolare i geni. pagina 16^Ink4a+ Cellule senescenti in alcuni tipi di cellule. Sn-pTracer consente un tracciamento preciso del lignaggio, mentre Sn-cTracer consente la resezione specifica del tipo di cellula, superando i limiti dei modelli precedenti privi di specificità.

Conclusioni

Per riassumere, studi precedenti che utilizzavano la clearance sistemica di… pagina 16^Ink4a+ Le cellule mancavano di specificità del tipo cellulare, ignorando le differenze nell’identità cellulare tra i tessuti. Per affrontare questo problema, sono state sviluppate quattro strategie genetiche specifiche dello studio pagina 16^Ink4a+ Tipi di cellule. Nella fibrosi epatica, i macrofagi senescenti promuovono la fibrosi, mentre le cellule dendritiche senescenti aiutano nella riparazione dei tessuti. Eradicazione pagina 16^Ink4a+ I macrofagi hanno ridotto la fibrosi, eliminandola pagina 16^Ink4a+ Correggi gli EC deboli. La riprogrammazione delle EC con sovraespressione di Kdr ne ha migliorato la funzione e ridotto la fibrosi, fornendo importanti spunti per lo sviluppo di terapie senolitiche in futuro.