Protocollo ottimale per prevenire la trasmissione di malattie attraverso il carryover del DNA mitocondriale materno

Molte malattie umane insorgono a causa di difetti nel DNA mitocondriale (mtDNA), che è diverso dal DNA nucleare ed è ereditato solo dagli antenati materni. La prevenzione di queste malattie mediante la terapia di sostituzione mitocondriale (MR) comporta il rischio di un aumento delle mutazioni del mtDNA, che possono successivamente portare alla deriva genetica mitocondriale.

Un recente studio pubblicato su Biologia PLoS Discute un nuovo metodo per ridurre il rischio di portare mutazioni del mtDNA aumentando la sopravvivenza e lo sviluppo del feto.

Soggiorno: Riduzione significativa del carryover mitocondriale materno mediante traslocazione complessa dei cromosomi del fuso. Credito immagine: nobeastsofierce / Shutterstock.com

introduzione

All’interno dei mitocondri, i substrati subiscono la fosforilazione ossidativa per generare adenosina trifosfato (ATP). I mitocondri contengono il loro DNA sotto forma di un cromosoma circolare a doppio filamento.

Sebbene il DNA mitocondriale sia molto corto e contenga solo 37 geni, le mutazioni possono derivare dall’ereditarietà o dalla deriva genetica durante lo sviluppo embrionale. La salute del feto dipende quindi dal livello di replicazione eterologa del mtDNA.

A livelli elevati, il mtDNA mutato può predominare e contribuire allo sviluppo di sintomi clinici come cecità, sordità, diabete, insufficienza epatica o debolezza muscolare. Questi sintomi possono comparire a qualsiasi età.

Ciò ha motivato i ricercatori a identificare metodi in grado di prevenire queste malattie evitando la loro trasmissione attraverso metodi come la risonanza magnetica. La risonanza magnetica comporta la sostituzione dei mitocondri dei gameti coinvolti nel concepimento o dell’embrione formato dal concepimento, utilizzando il trasferimento del fuso o altri metodi.

Cos’è l’SCCT?

Una delle tecniche MRI standard è la traslocazione del complesso cromosomico del fuso (SCCT). Qui, i ricercatori manipolano la formazione del fuso durante la metafase II (MII) della divisione cellulare, in cui i cromosomi si separano dai poli cellulari e si attaccano alle fibre del fuso. I cromosomi materni e paterni si separano ai poli opposti della cellula.

Nell’SCCT, dall’uovo non fecondato viene rimosso il fuso a cui sono attaccati i cromosomi di origine materna, che rappresenta il DNA di origine materna. Questi cromosomi vengono poi trasferiti mediante un’attenta manipolazione nell’ovulo ricevente di una donna donatrice, dal quale è stato estratto il nucleo dall’ovulo vuoto.

Successivamente avviene la fecondazione dell’uovo nuovo o ricostruito. Fecondazione e sviluppo riusciti sono stati riportati negli ovociti di scimmia rhesus, seguiti da esperimenti simili negli ovociti umani. L’analisi delle blastocisti e delle linee cellulari embrionali (ESC) in questi modelli animali ha mostrato che i livelli del mtDNA non erano rilevabili.

La prima nascita umana dopo una gravidanza utilizzando SCCT è avvenuta in Messico nel 2017 e ha coinvolto tre padri.

Anche con SCCT, la deriva genetica mitocondriale è stata segnalata in diversi esperimenti. Ciò può essere dovuto al fatto che il complesso cromosomico del fuso (SCC) è dotato di una piccola quantità di citoplasma che contiene alcuni mitocondri, con conseguente trasferimento del mtDNA eterologo o mutante all’uovo ricevente. Ciò espone le uova così costruite al rischio di deriva genetica. Pertanto, l’individuo concepito da queste uova corre un rischio maggiore di sviluppare successive malattie mitocondriali.

I limiti di queste tecniche hanno portato i ricercatori del presente studio a studiare un nuovo metodo per la micromanipolazione durante l’SCC. Lo scopo di questo studio era ridurre il rischio di carryover del DNA mitocondriale, prevenendo così i rischi genetici e la malattia mitocondriale clinica. Il nuovo metodo proposto nel presente documento si chiama rimozione massima residua (MRR).

Cos’è l’MRR?

Gli SCC sono stati rimossi dagli ovociti umani e di topo utilizzando una micropipetta. Il citoplasma che circonda l’SCC è stato successivamente rimosso mediante una tecnica di “swing away” in una miscela brevettata. Sono state valutate le singole cellule staminali per garantire che l’MRR fosse raggiunto e che i numeri di copie del mtDNA e la variazione del numero di copie del gene (CNV) fossero intatti.

Successivamente, gli ovociti di topo sono stati ricostruiti utilizzando il mtDNA di cellule diverse. Lo sviluppo degli ovociti è stato esaminato dopo la fecondazione mediante iniezione intracitoplasmatica degli spermatozoi (ICSI) allo stadio di blastocisti. Sono stati inoltre determinati il ​​livello di variazione del DNA e il numero di copie cromosomiche.

L’SCCT ha attivato l’ovocita ricostruito troppo presto e, di conseguenza, ne ha causato l’ingresso in meiosi e una fecondazione prematura anomala. Per superare questo problema è stata eseguita prima l’ICSI e poi l’MRR.

Questo nuovo approccio ha aumentato il successo della fecondazione e ha ridotto il tempo necessario e il numero di ovociti da sacrificare. Anche l’SCC è rimasto morfologicamente intatto dopo queste procedure e l’analisi della CNV ha mostrato un numero di copie cromosomiche normale.

Questo nuovo approccio alla rimozione dei mitocondri nella MRR non influirà sull’integrità del fuso e dei cromosomi e potrà essere facilmente eseguito nella traslocazione nucleare“.

La procedura SCC-MRR non ha impedito la normale fecondazione e il successivo sviluppo embrionale.

Le uova fecondate venivano impiantate negli ovidotti, dando origine a prole sana in circa il 30% dei casi. Questo è molto simile all’efficacia del tradizionale trasferimento di embrioni SCC. L’eterogeneità del mtDNA era di circa l’1,5% nella prole SCCT-MRR rispetto a circa il 4,1% nei feti SCC convenzionali.

Questa prole è cresciuta fino all’età adulta e si è accoppiata naturalmente con maschi selvatici. Anche la progenie della seconda generazione mostrava bassi residui di mtDNA pari a circa lo 0,5%.

Le linee ESC SCCT-MRR apparivano e si comportavano come linee di controllo e linee ESC stabili, mentre gli SCCT-ESC convenzionali mostravano una maggiore eterogeneità del mtDNA. Pertanto, questo metodo non ha portato alla deriva genetica del mtDNA.

MRR-SCCT può ridurre fortemente la migrazione del mtDNA del donatore del fuso al livello più basso di stato stazionario nei mESC.“.

Queste manipolazioni sono state eseguite anche durante la fase MII dell’ovocita, con conseguente sviluppo corretto di embrioni SCCT-MRR con riporto minimo del mtDNA. Utilizzando questa tecnica, il carryover del mtDNA è diminuito allo 0,04%, il livello più basso mai riportato negli studi SCCT sull’uomo.

L’alto tasso di fecondazione, la proporzione di embrioni che progredivano allo stadio di blastocisti e i livelli di ploidia erano simili agli ovociti umani derivati ​​da ICSI non trattati.

Quali sono le implicazioni?

I livelli del mtDNA sono costantemente diminuiti a livelli molto bassi e stabili nei nucleoplasti, negli ovociti ricostruiti e nei derivati ​​della blastocisti dopo SCCT-MRR. Inoltre, i livelli del mtDNA erano circa un sesto di quelli risultanti dal SCCT convenzionale nei topi e rimanevano stabili nella prima e nella seconda generazione di prole.

Questi risultati supportano l’ipotesi che un aumento del mtDNA residuo sia associato ad un aumento del rischio di deriva genetica. Inoltre, questo approccio non sembra aumentare il rischio di difetti cromosomici del fuso indotti dalla manipolazione.

Precedenti ricerche sull’infertilità umana hanno dimostrato che una diminuzione del carryover del mtDNA allo stadio di blastocisti è ancora seguita da un aumento dallo 0,8% al 60% in vari tessuti al momento della nascita. Questa deriva della covarianza è stata osservata anche in altri esperimenti con ESC umani.

Pertanto, riteniamo che saranno necessarie ulteriori indagini sulle ESC umane prima della traduzione clinica dell’attuale strategia MRR-SCCT.“.